Metodo 1: metodo di estrazione (il metodo attualmente utilizzato nel mio paese; garantisce una purezza inferiore ma offre costi di produzione inferiori.)
Estrazione della soluzione di ossitocina: prendere 100 g di polvere essiccata dell'ipofisi posteriore e 30 g di polvere di quarzo, metterli in un mulino a palle e aggiungere acqua distillata. Eseguire l'estrazione quattro volte utilizzando la stessa procedura. I volumi di acqua distillata aggiunti per ogni passaggio sono i seguenti: 1,4 L per le prime due estrazioni e 1,3 L per le due successive. Ogni estrazione viene effettuata per 45 minuti, seguita da centrifugazione per raccogliere il liquido; il restante residuo viene poi sottoposto ad ulteriore estrazione. I quattro estratti risultanti vengono combinati per produrre la soluzione di ossitocina. In sintesi: polvere essiccata dell'ipofisi posteriore [acqua, mulino a palle] → Estratto di ossitocina → Separazione cromatografica.
Prendi 1.500 g di zeolite sintetica pre-trattata, aggiungi 20 L di una soluzione di acido acetico allo 0,25% e-dopo aver agitato-versa la miscela in una colonna a scambio ionico-. Una volta che il livello della soluzione di acido acetico è sceso fino a un punto 2–3 cm sopra la superficie del letto di zeolite, introdurre immediatamente l'estratto di ossitocina. Mantenere una portata adeguata e raccogliere l'eluato bianco e torbido risultante (questa frazione contiene principalmente ossitocina; poiché l'ossitocina ha un punto isoelettrico [pI] di 7,7-mentre la vasopressina ha un pI di 10,9-vasopressina forma facilmente ioni positivi e viene quindi adsorbita sulla colonna). Non appena il livello liquido dell'estratto scende sulla superficie del letto di zeolite, aggiungere immediatamente acqua distillata e continuare a raccogliere l'eluato torbido fino alla cessazione del flusso. Regolare il pH dell'eluato torbido raccolto a 3,5 utilizzando acido acetico glaciale. Riscaldare rapidamente la soluzione a bagnomaria a 95 gradi, mantenere questa temperatura per 3 minuti, quindi raffreddare rapidamente la soluzione e refrigerarla durante la notte. In sintesi: Estratto di ossitocina [HAc, colonna di zeolite sintetica] → Eluato torbido [HAc, riscaldamento] → Soluzione separata → Adsorbimento ed eluizione. Il giorno successivo filtrare la soluzione refrigerata. Al filtrato, aggiungere un impasto liquido di bentonite al 10% mescolando (aggiungendo 3 mL di impasto liquido per 100 mL di filtrato). Continuare ad agitare per 1 ora per facilitare l'assorbimento, quindi centrifugare la miscela. Testare il liquido surnatante utilizzando una soluzione reagente di acido solfosalicilico; l'assenza di qualsiasi precipitato indica che il processo di adsorbimento è completo. Se l'adsorbimento risulta incompleto ripetere il processo di trattamento con bentonite; successivamente, unire i precipitati di bentonite ottenuti da entrambe le fasi di adsorbimento. La bentonite viene eluita quattro volte utilizzando acido acetico all'1% (con volumi di 1,6 L, 1,4 L, 1,2 L e 0,8 L, rispettivamente). Per ciascun eluato, viene aggiunto *tert*-butiltricloruro una volta che la soluzione viene riscaldata a 80 gradi; la temperatura viene quindi aumentata a 95 gradi, raffreddata rapidamente a 25 gradi e filtrata o centrifugata. I quattro filtrati risultanti vengono combinati per determinare la potenza e il limite della vasopressina. Il flusso del processo è il seguente: Soluzione refrigerata [Filtrazione] → Filtrato [Liquame di bentonite] → Adsorbato [1% HAc] → Eluato. Preparazione dell'iniezione di ossitocina:
La soluzione di ossitocina analizzata, dopo aver soddisfatto gli standard di qualità, viene diluita a una concentrazione di 5 U/mL o 10 U/mL. Viene quindi filtrato attraverso un imbuto di vetro sinterizzato No. 4 o No. 5, riempito in fiale e sterilizzato utilizzando vapore corrente a 100 gradi per 30 minuti per ottenere il prodotto finale. Il flusso del processo è il seguente: Soluzione di ossitocina (saggio approvato) [Filtrazione, riempimento, sterilizzazione] → Iniezione di ossitocina.
Rigenerazione della zeolite sintetica: la zeolite sintetica viene lavata due volte con acqua distillata. Successivamente si aggiungono 1,5 L di acqua (calcolati sulla base di 500 g di zeolite) e 150 g di cloruro di sodio e la miscela viene agitata per 2 ore per lavare via ed eliminare la vasopressina. La zeolite viene quindi lavata con acqua distillata finché non rimangono più ioni cloruro. Si aggiunge una quantità adeguata di acqua e si regola il pH a 9 utilizzando idrossido di sodio; la miscela viene agitata per 30 minuti, dopodiché il surnatante viene decantato. La zeolite viene lavata con acqua distillata, il pH viene regolato a 5,5–6 utilizzando acido solforico e viene nuovamente lavata con acqua fino a raggiungere la neutralità. Viene quindi filtrato per rimuovere l'acqua in eccesso ed essiccato a 105 gradi per un uso futuro. Prima dell'uso, viene aggiunta una quantità adeguata di acqua e il pH viene regolato utilizzando acido acetico glaciale mescolando per consentire l'ammollo. Preparazione dell'impasto liquido di bentonite al 10%: la bentonite e l'acqua vengono miscelate con un rapporto massa-a-volume di 1:10. La miscela viene macinata per circa 1 ora, durante la quale viene aggiunto acido acetico per mantenere un pH stabile di 3,5. L'impasto risultante viene quindi conservato in frigorifero per un utilizzo futuro. Metodo 2: sintesi chimica. Innanzitutto, l'eptapeptide ammide (segmenti 3–9) viene sintetizzato a partire dal benzilossicarbonil-leucina *p*-nitrofenil estere; successivamente, viene sintetizzata la benzilossicarbonil-S-benzilcisteina-tirosina azide (segmenti 1–2); e nella terza fase viene sintetizzata l'ossitocina.