L'analisi della purezza dei peptidi viene generalmente eseguita utilizzando la cromatografia liquida ad alte-prestazioni (HPLC). L'obiettivo primario dell'analisi della spettrometria di massa è confermare il peso molecolare; attualmente, le principali tecniche utilizzate per l'analisi dei peptidi sono la spettrometria di massa a ionizzazione elettrospray (ESI-MS) e la spettrometria di massa a desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice (MALDI-MS).
L'analisi della composizione aminoacidica rivela i tipi e le quantità di aminoacidi presenti in un peptide, mentre il principio fondamentale alla base dell'analisi della sequenza aminoacidica è la degradazione di Edman.
I metodi per identificare le strutture secondarie dei peptidi includono il dicroismo circolare (CD), la risonanza magnetica nucleare (NMR), la diffrazione dei raggi X, tra gli altri.
Durante il processo di sintesi in fase solida-, possono essere generate varie impurità-come sequenze di delezione, sequenze di inserimento, peptidi -erroneamente accoppiati, peptidi epimerizzati e peptidi ossidati-. L'identificazione di tali impurità correlate ai peptidi- viene generalmente effettuata utilizzando la cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem (LC/MS/MS); La LC-MS consente la determinazione accurata della massa di un peptide, mentre la MS/MS viene utilizzata per chiarirne la sequenza. Inoltre, è possibile impiegare tecniche cromatografiche HPLC per ottenere una separazione e un rilevamento efficaci.
Nella sintesi peptidica in fase-solida, l'efficienza dell'accoppiamento viene valutata principalmente rilevando la presenza di gruppi amminici liberi sulla resina; questo metodo di rilevamento è noto come test di Kaiser (o test della ninidrina). Se sono presenti gruppi amminici liberi, si sviluppa un colore blu o bruno-rossastro-.